簡(jiǎn) 介
ADAR酶在RNA中針對(duì)位于特定雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)中的腺苷?qǐng)?zhí)行A-to-I編輯。ADAR1有兩種亞型——p150和p110，它們通過(guò)使用單獨(dú)的啟動(dòng)子和交替剪接產(chǎn)生的。
Fig 1. ADAR editor靶向的雙鏈mRNA環(huán)示例
ADAR1功能喪失突變導(dǎo)致dsRNA傳感器的異常激活。ADAR1在多種腫瘤中高表達(dá)，并且ADAR1基因敲除可以改善對(duì)特定免疫治療（如PD-1/PD-L1阻斷）的反應(yīng)，并繞過(guò)腫瘤免疫治療抵抗機(jī)制，這使ADAR1成為治療開(kāi)發(fā)的具有前景的靶點(diǎn)。
原 理
細(xì)胞系含有可作為ADAR1編輯靶標(biāo)的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)位于Firefly熒光素酶基因的上游，且包含終止密碼子（UAG），并可在ADAR1介導(dǎo)的編輯下轉(zhuǎn)變?yōu)樯彼幔║UG）密碼子。
結(jié) 果
ADAR1過(guò)表達(dá)的HEK293細(xì)胞顯示出高熒光素酶活性，此活性在siRNA介導(dǎo)的ADAR1表達(dá)敲低后減少。
Fig 2. 三種ADAR1報(bào)告基因細(xì)胞系的原理
ADAR1報(bào)告基因結(jié)構(gòu)包含一個(gè)含有終止密碼子（UAG）的ADAR1靶點(diǎn)，該密碼子位于編碼Firefly熒光素酶的序列的上游。在沒(méi)有ADAR1的情況下，熒光素酶不會(huì)轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞無(wú)熒光素酶活性。在存在ADAR1活性的情況下，腺嘌呤被轉(zhuǎn)化為肌苷，所得的密碼子對(duì)應(yīng)氨基酸色氨酸（UUG），從而使熒光素酶的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)成為可能。因此，ADAR1活性與熒光素酶活性直接相關(guān)。
選擇HEK293細(xì)胞是因?yàn)樗鼈兊膬?nèi)源性ADAR1表達(dá)相對(duì)較低。
ADAR1 Responsive Luciferase Reporter Cell Line（ #82238）需要轉(zhuǎn)導(dǎo)并穩(wěn)定整合報(bào)告基因結(jié)構(gòu)。該細(xì)胞需要經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染才能表達(dá)ADAR1，并誘導(dǎo)熒光素酶的表達(dá)。
ADAR1 Activity Luciferase Reporter Cell Line（ #82239）是通過(guò)將ADAR1轉(zhuǎn)導(dǎo)到#82238，然后進(jìn)行抗生素篩選和克隆而生成的。
ADAR1 Activity Two-Luciferase Reporter Cell Line（ #82240）是從#82239改造而成，可穩(wěn)定表達(dá)Renilla熒光素酶。Renilla熒光素酶活性作為細(xì)胞活力的指標(biāo)，讓用戶在評(píng)估化合物對(duì)ADAR1活性影響的同時(shí)評(píng)估其毒性。
Fig 3. ADAR Reporter #2具有最佳的ADAR1響應(yīng)和選擇性。
使用三種報(bào)告基因設(shè)計(jì)，生成了HEK293 cell pool，并使用轉(zhuǎn)染ADAR1質(zhì)粒的瞬轉(zhuǎn)來(lái)篩選敏感性高，響應(yīng)強(qiáng)的細(xì)胞系。
鑒于ADAR1和ADAR2的RNA靶標(biāo)序列存在重疊，ADAR2過(guò)表達(dá)可能產(chǎn)生的影響。圖3A顯示，三種ADAR報(bào)告基因中的兩種在ADAR1過(guò)表達(dá)時(shí)觸發(fā)了熒光素酶活性。其中，ADAR Reporter #2在ADAR2表達(dá)時(shí)沒(méi)有響應(yīng)，與ADAR Reporter #1相比，ADAR Reporter #2對(duì)ADAR1具有更好的特異性（圖3B）。因此，選擇ADAR Reporter #2制備穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。
ADAR1響應(yīng)型報(bào)告基因細(xì)胞系
Fig 4. 穩(wěn)轉(zhuǎn)ADAR1響應(yīng)型報(bào)告細(xì)胞系對(duì)ADAR1有響應(yīng)，對(duì)ADAR2無(wú)響應(yīng)。
從表達(dá)Reporter #2的HEK293 cell pool中選擇穩(wěn)定的、單克隆細(xì)胞系。通過(guò)瞬轉(zhuǎn)ADAR2或ADAR1的p150或p110亞型，比較熒光素酶活性。
結(jié)果表明，與p110相比，對(duì)ADAR1 p150活性的偏好響應(yīng)，ADAR2過(guò)表達(dá)時(shí)檢測(cè)到的熒光素酶活性很小。
在21代的穩(wěn)定性測(cè)試中，該細(xì)胞系一直維持的熒光素酶活性。
ADAR1活性熒光素酶報(bào)告細(xì)胞系
為了，通過(guò)將ADAR1 p150亞型通過(guò) 慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)到ADAR1響應(yīng)型報(bào)告HEK293細(xì)胞系中，生成ADAR1過(guò)表達(dá)HEK293細(xì)胞系，可評(píng)估ADAR1為靶點(diǎn)的化合物。
ADAR1的siRNA knockdown使熒光素酶活性減少，說(shuō)明熒光素酶活性來(lái)自ADAR1過(guò)表達(dá)（圖5B）。ADAR1 knockdown并不誘導(dǎo)細(xì)胞毒性（圖5C）。因此，細(xì)胞死亡并未導(dǎo)致觀察到的熒光素酶活性降低。
將96孔板和384孔板進(jìn)行比較顯示，與對(duì)照組相比，細(xì)胞系具有強(qiáng)且穩(wěn)定的信號(hào)（圖6）。
Fig 5. ADAR1活性熒光素報(bào)告HEK293細(xì)胞系中的熒光素酶活性源于ADAR1的表達(dá)。
Fig 6. ADAR1過(guò)表達(dá)的報(bào)告基因細(xì)胞中ADAR1依賴的熒光素酶活性一致性高。
ADAR1活性雙熒光素酶報(bào)告細(xì)胞系該細(xì)胞系可同時(shí)評(píng)估ADAR1活性和化合物誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。ADAR1活性報(bào)告熒光素HEK293細(xì)胞系可穩(wěn)定、持續(xù)表達(dá)Renilla熒光素酶。Firefly和Renilla熒光素酶活性都與細(xì)胞密度相關(guān)（圖7）。
圖7. 在ADAR1活性雙熒光素酶報(bào)告基因細(xì)胞系中，F(xiàn)irefly熒光素酶和Renilla熒光素酶信號(hào)與細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)。
三種細(xì)胞系可支持ADAR1研究的不同方面：
ADAR1 Responsive Luciferase Reporter Cell Line（ #82238）可比較ADAR1修飾和突變對(duì)ADAR1活性的影響，例如研究結(jié)構(gòu)/功能關(guān)系，或者研究RNA編輯的ADAR1變體。
ADAR1 Activity Luciferase Reporter Cell Line（ #82239）穩(wěn)定表達(dá)ADAR1，適用于評(píng)估ADAR1調(diào)節(jié)劑（如小分子抑制劑）的療效?？蛇M(jìn)行高通量篩選。
ADAR1 Activity Two-Luciferase Reporter Cell Line（ #82240）可在評(píng)估靶向ADAR1化合物（如小分子抑制劑）的效力的同時(shí)，進(jìn)行毒性測(cè)定。
您的位置：
更新時(shí)間：2024-07-11 
瀏覽次數(shù)：774
